Впервые западные разведчики и ави­ационные специалисты увидели Е-266 на авиационном параде, со­стоявшемся 9 июля 1967 года в Домо­дедово. Над зрителями промчались три Е-155П и один Е-155Р-3, которые пило­тировали военные летчики-испытатели Г. А. Горовой, И. И. Лесников, В. И. Петров и летчик-испытатель горьковского завода Г. Б. Вахмистров.

Новейшие перехватчики начали по­ступать в подразделения ВВС, как это нередко случалось в истории советской авиации, задолго до официального принятия на вооружение. Первым в 1969 году МиГ-25П получил 148-й Центр боевого применения и переучивания личного состава ИА ПВО в Саваслейке. Первым строевым полком, перевооруженным на МиГ-25П, стал 786-й иап, дислоцировавшийся в Правдинске. Как ни странно, но количество летных происшествий, учитывая фантастические летные данные самолета, оказалось низ­ким, хотя в ряде случаев летчики переу­чивались на МиГ-25П с МиГ-17, так как спарок не хватало.

Перехватчиками МиГ-25 были воо­ружены истребительные авиационные полки авиации ПВО страны. Стоит на­помнить, что в СССР ПВО представляли собой отдельный вид вооруженных сил, в состав которого входила истребительная авиация (ИА ПВО), которая к ВВС не относилась. За рубежом Советского Союза МиГ-25П практически не встречались, лишь в 1980-е годы в ГДР перебросили вооруженные МиГ-25ПД/ПДС полки. Основным назначением МиГ-25 являлось выполнение перехвата скоростных высотных целей. МиГ-25 часто взлетали на перехваты и сопровождение американских разведчиков SR-71. С появлением крылатых ракет летчики стали отрабатывать полеты на малых высотах.

С середины 1980-х годов в войсках начался процесс замены перехватчиков МиГ-25 на МиГ-31. В 1992 году в России произошла крупная реорганизация авиации ПВО, при этом 11 полков подверглось сокращению, которое сопровождалось массовым списанием перехватчиков МиГ-25П и Су-15. В числе последних МиГ-25ПД/ПДС эксплуатировали 790-й иап (Хотилово), 786-й иап (Правдинск), 764-й иап (Пермь), 85-й иап (Ростов-на-Дону) и 458-й (Котлас). Возможно, последним летающим МиГ-25ПУ был самолет, принадлежавший школе летчиков-испытателей ЛИИ им. М.М. Громова.

После развала СССР часть «двадцать пятых» осталась за пределами России. Наиболее радикально поступили с МиГ-25 на Украине, списав все доставшиеся им 79 машин. На вооружение ВВС Азербайджана поступили несколько перехватчиков, которые применялись в ходе войны в Нагорном Карабахе. Перехватчики МиГ-25 поступили на вооружение ВВС Белоруссии и Туркмении.

Поставки МиГ-25 на экспорт начались в 1979 году. МиГ-25 в вариантах разведчика и перехватчика поступили на вооружение ВВС Алжира, Ирака, Ливии и Сирии. Алжир получил в конце 1970-х — начале 1980-х годов 36 МиГ-25 разных модификаций. Ливийские МиГ-25ПД в 1980-е годы часто выполняли перехваты палубных самолетов ВМС США и облеты кораблей американского 6-го флота. В начале января 1986 года пара ливийских МиГ-25 перехватила ЕА-6 В с авианосца «Китти Хок».

Сирия получила в общей сложности около сорока МиГ-25, большей частью перехватчиков. Сирийцы первыми провели воздушные бои на «трехмаховых» истребителях. Первый бой состоялся 13 февраля 1981 года над Ливаном. Ирак получил порядка 20 перехватчиков МиГ-25 в 1980-1981 годах. В ходе операции по освобождению Кувейта в 1990-1991 годах ВВС Ирака потеряли два МиГ-25.